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elisa試劑盒操作方法、ELISA測定出現問題及解決
更新時間:2023-07-06瀏覽:961次

  elisa試劑盒操作方法、ELISA測定出現問題及解決


  雙抗體夾心法

  1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃ 過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。

  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

  3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時,洗滌。

  4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。

  5. 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

  6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零后測各孔OD值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。


404.png


  間接法

  1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜;

  2.次日洗滌3次;

  3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;

  4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml;

  5.37℃孵育35-60分鐘,洗滌;

  6.’最后一遍用DDW洗滌。

  其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

  ELISA測定中可能會出現的問題及可能的原因:

  可能的原因(非試劑盒本身的原因)

  1.弱陽性質控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠;顯色反應時間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問題

  2.測定的重復性差 (相同樣本兩次測定結果不一致) 這是典型的由測定操作引起的問題,包括

  (1)加樣本及試劑量不準;孔間不一致;

  (2)加樣過快,孔間發生污染;

  (3)加錯樣本;

  (4)加樣本及試劑時,加在孔壁上部非包被區;

  (5)不同批號試劑盒中組分混用;

  (6)溫育時間、洗板、顯色時間不一致;

  (7)孔內污染雜物;

  (8)酶標儀濾光片不正確;

  (9)血清標本未凝固即加入,反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞,易出現假陽性反應等。

  3.白板 (陽性對照不顯色)

  (1)漏加酶結合物;

  (2)洗板液配制中出現問題,如量筒不干凈,含酶抑制物(如疊氮鈉)等。

  (3)漏加顯色劑A或B;

  (4)終止劑當顯色劑使用。

  4.全部板孔均有顯色

  (1)洗板不干凈;

  (2)顯色液變質;

  (3)加底物的吸光受酶污染;

  (4)洗板液受酶等污染

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